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临床实验室分子诊断的标准化

作者：佚名 文章来源：互联网 点击数：132 更新时间：2009-8-10

转载

临床实验室分子诊断的标准化

李金明 卫生部临床检验中心 100730

[摘要] 临床实验室分子诊断涉及病原体核酸
、人类基因和各种蛋白等大分子的测定 ，在许多临床疾病的诊断方面
，有极为关键的作用 。工作程序、试剂方法的标准化以及标准物质的应用，是保证实验室检验结果准确性的前提
。在日常检验工作中应用标准物质 ，将极大地改善不同实验室间检验结果的可比性
，从而逐步实现不同实验室间检验结果有条件的互认。

[关键词] 分子诊断；标准化；标准物质

临床实验室分子诊断现已成为临床检验各学科分支中最具发展潜力的领域，其涉及病原体核酸 、人类基因和各种蛋白等大分子的测定 ，是临床疾病诊断中不可或缺的手段 。但在临床应用中，目前仍存在同一实验室不同检测批次间或不同实验室对同一标本检测间结果的差异
，这已成为时常困扰临床医师
、患者以及实验室技术人员的普遍性问题
。此外，这也是当前不同实验室间结果有条件互认的一个巨大障碍。而造成不同临床实验室间检验结果差异的原因 ，通常包括临床标本的采集、试剂方法 、测定操作
、仪器设备的维护校准、数据处理及结果报告 、标准物质及质控物的应用等方面的不规范等因素 。然而
，仪器设备
、试剂生产厂家和临床实验室本身在临床实验室分子诊断标准化中起着非常关键的作用
。通常，临床实验室分子诊断标准化应主要包括以下几个方面。

一、 临床标本采集 、运送和保存的标准化

临床标本的采集
、运送和保存对检验结果往往有决定性的影响 ，而这些问题常涉及临床实验室与其他相关科室的工作分工与协作
，此点以前不太被关注或认为是难以控制的问题 。但为保证得到正确的检验结果，必须制定一个规范的临床标本采集、运送和保存的程序
。

常用的临床标本通常有血清（浆） 、全血、分泌物
、组织、尿液 、脑脊液及其他体液等 ，对这些标本的采集
、运送和保存的标准化主要是对标本采集的具体方法、所用容器 、采集量
、采集时所用材料和用具、运送方式和不同时间中标本保存条件等做出明确而又详尽的规定
，写成标准操作程序（standard operation procedures, SOP）；并对参与该程序运行的相关人员进行必要的培训，及时与临床科室进行全面而有效的“对话
”（包括工作沟通 、定期质量评价
、纠错措施） ，是保证所制定的程序得到确实执行的必不可少的环节。

二、 临床标本制备处理和核酸提取方法的标准化

临床标本的处理对于分子诊断技术
，尤其是核酸和基因检测是极为关键的一个环节 。在抗原和抗体的免疫学测定中，临床标本中存在的干扰物质 ，如类风湿因子（RF） 、补体及其他非特异因子等有可能会造成定性测定的假阳性或假阴性结果或使定量测定结果偏高或偏低。在检测前，对标本进行适当的稀释
、加热或其他适当的预处理则可去掉这种干扰作用
。

在核酸和基因检测中
，临床标本中存在的血红蛋白、免疫球蛋白G（IgG） 、乳铁蛋白、核酸酶
、尿素、胆盐 、黏蛋白和多糖等，都能在聚合酶链反应（PCR）扩增过程起抑制作用 ，而影响特定靶核酸的检测。采用简便而又高效的核酸纯化方法
，去掉临床标本中的上述PCR抑制物，是保证得到正确的检测结果的前提 。有些临床标本如痰[ 6,7] ，在核酸提取前
，对标本进行适当
、有效的预处理，对保证后续核酸提取以及扩增检测的成功非常关键
。此外 ，在临床分子诊断中
，必须建立一个标准化的临床标本制备处理程序，这对于核酸提取、提取的效率及能否有效地去掉PCR抑制物 ，也是核酸纯化方法标准化的重要指标。

三 、检测试剂和方法的标准化

组成一个可用于临床分子诊断的试剂和方法模式
，可有多种选择，如PCR因其极高的检测灵敏度 ，很容易因以前扩增产物或标本间交叉污染，而出现假阳性结果 。此外
，标本中PCR抑制物的存在
、扩增仪孔间温度的差异、试剂的浓度不合适以及标本中核酸提取的失败等，则容易造成假阴性结果[1,8]
。因此 ，试剂生产厂家在研发相应的临床分子诊断试剂时
，必须仔细考虑上述因素，采用最理想的检测方法。如PCR试剂则应从如何有效避免假阳性和假阴性结果的角度出发 ，在试剂盒中以dUTP替代4种dNTP中的dTTP
，再加上尿苷糖基酶（UNG），使扩增产物DNA中出现天然DNA中所没有的U ，在新的检测扩增中
，如有以前扩增产物的污染，则其可在UNG的作用下被降解 。这样可一定程度地避免以前扩增产物污染所致的假阳性
。又如在试剂中加入竞争性或非竞争性内标 ，则可有效监测核酸提取 、扩增及产物分析中出现的误差
，从而避免假阴性结果。

四
、检测结果分析的标准化[9-11]

临床实验室分子诊断方法依其对测定结果的表达方式，可分为定性和定量两大类 。定性测定常以“有”或“无 ” ，也即“阳性
”或“阴性”来表达测定结果
。定量测定的结果则以浓度（如IU/L、IU/ml 、μg/L
、拷贝数/ml等）的方式表达。定性测定结果确定的依据在于阳性判定值（cut-off）的建立，cut -off 值的确立应尽可能地避免假阳性或假阴性结果的出现 。定量测定的依据为使用系列浓度标准品测得的剂量反应曲线（即标准曲线）或是内标的量。

定性测定中设定cut-off 值是为了尽可能地避免假阳性或假阴性结果
，但处于cut-off 值一定范围的测定结果具有某种不确定性，通常称为“灰区 ”
。在临床实际检测中 ，“灰区
”范围大小的确定以及处于“灰区”范围内的临床标本的结果如何报告
，常使实验室技术人员感到困惑。因此，对其进行标准化的程序规定 ，不但可使实验室技术人员在报告结果时有规则可循
，而且可有效减少或避免错误结果的发出 。

定量测定的数据处理，常采用不同的数学模式 ，这不仅可用来改善标准曲线绘制的精密度
，从而以较少的数据和计算获得较为准确的结果，又能省时、省钱
。如今微型计算机已在临床实验室中迅速普及 ，各种测定数据处理软件层出不穷
，使得定量测定结果的表达更为准确和有效。例如：实时荧光定量PCR对阈值的设定，标准曲线中斜率 、截距和相关系数的允许变化范围在其数据处理和结果报告的标准操作程序中做出明确规定 。在以纵坐标为Ct值（特定靶核酸扩增曲线与阈值线相交时的扩增循环数） ，横坐标为起始拷贝数的实时荧光定量PCR（目前绝大部分为此类）时，斜率A = -
，其中E为扩增效率；截距B = log YCt，其中YCt为达到特定靶核酸扩增曲线与阈值线相交时的扩增循环数时的扩增产物的量
。因此 ，斜率A与特定实时荧光PCR的扩增效率有关
，当扩增效率为100%，即1时 ，A为-3.32
，可见一个特定实时荧光定量PCR方法，其斜率应≤-3.32 ，越大说明效率越高。截距B则为原始模板趋向于0时
，亦阴性标本检测的Ct 值，因此 ，一个实时荧光PCR
，如果设定的扩增循环数为40，则其截距B即应≥40 。

理想情况下 ，测定数据处理报告应达到下述要求：（1）通俗易懂
。要让所报告的结果，即使是不熟悉该试验的人
，也能理解。（2）定性测定结果明确 。即反应或不反应、阳性或阴性
、在正常范围内或不正常等
。（3）定量测定须有一定的线性范围。（4）处理后得到的数据要具有可重复性 。（5）试验的评价不应建立在假定的正态分布上。（6）应有适当、合理的解释
。

五 、标准物质和质控物的应用[2,12-26]

标准物质是临床分子诊断标准化的核心，也就是说 ，临床检测的某一标本中特定标志物的量值
，不管其用什么方法测定，均可以通过统一的标准物质 ，而得到相近的结果
，其量值均可溯源至同一标准，从而具有可比性。

标准物质可归类为第一
、第二和第三3个等级 。一级标准物质数量有限 ，可使用10至20年
，其为冻干品
。一级标准可用来校准第二和第三级标准。例如，常规测定中使用的校准物质 。国际标准可作为第一级标准物质 ，一旦第一级标准确定
，二级标准可用来维持校准
。校准的二级标准可在以国家为基础的范围内供应。目前可得到的国际标准物质中特定分析物的浓度一般以IU/L表示，也可用mol/L和g/L来表示 ，后者通常是分子结构清楚的物质 。

在临床测定中所使用的校准品的值,溯源至一级标准的值,通常由下述几个校准步骤组成，即标准品和测定方法、缓冲液及其基质 、稀释的控制
、最终结果的统计学评价和质量控制等
。当建立一个测定方法时
，通过上述过程可将一级标准物质的值传递至二级、三级标准品和（或）校准品，使得所建立方法的测定值可溯源至一级标准物质。当引入一批新的试剂时 ，即需要重复这种传递过程
，从而保持校准的可靠性 。

标准物质定值的测定方法可使用决定性方法 、参考方法和确定程序的多中心测定
。决定性方法（definitive method）是一个具有高精密度及没有系统偏差的参考方法。当没有决定性方法可使用时，则可确定一个参考方法 。参考方法的变异要大于决定性方法。在蛋白质
、核酸和基因检测中 ，目前很少有参考方法
，国际上对标准品的定值通常是遵循一定的程序，采用多个参考实验室联合定值的模式 ，结果均以IU/L表示
，通常是根据一定的统计学方法，以大部分实验室能检出的最低含量定为1 IU/L
。

质控品则是含量已知的处于与实际标本相同的基质中的特性明确的物质。这种物质通常与其他杂质混在一起 ，根据其用途可分为室内质控品、室间质评样本和质控血清盘等3类 。室内质控品用于临床实验室日常工作的室内质控
，其定值应可溯源至二级标准品
。室间质评样本则由主持室间质评的机构制备或监制，通常无需准确的定值 ，但对于定性测定，则需用各种已有的方法
，以明确其阴阳性。质控血清盘为经过筛检得到的有明确阴阳性的原血清标本，阳性强弱不一 ，阴性标本则可能含有对测定会产生非特异干扰的物质
，阴阳性血清总数之比通常为1:1，血清盘可用于特定的定性免疫测定试剂盒的质量评价 ，评价内容包括特异性 、敏感性
、符合率和对可能存在的非特异干扰物的拮抗能力 。

目前国际上
，可用于临床分子诊断的国际一级标准物质已有很多，如血清蛋白、免疫球蛋白 、细胞因子、激素
、一些肿瘤标志物〔甲胎蛋白（AFP）、前列腺特异抗原（PSA） 、癌胚抗原（CEA）
、人绒毛膜促性腺激素（hCG）等〕、病毒核酸（HAV 、HBV
、HCV、HIV-1 、HPV B19等）和病原体抗原和抗体（HBsAg
、抗HBs）等
。这些标准物质均由一些国际标准化组织和机构提供 ，如英国国家生物学标准和质控物研究所（NIBSC）、美国疾病预防控制中心（CDC） 、美国病理学家协会（CAP）的国家委员会
、国立卫生研究所（NIH）等。在国内
，中国药品生物制品检定所和卫生部临床检验中心则提供一些相应的国家标准物质 。

六、工作程序 、试剂方法、标准物质和实验室结果可比性的关系

从图1中可见，在临床分子诊断标准化诸要素中 ，标准物质是获得具有可比性结果的前提
。但光有标准物质还不行
，试剂方法和工作程序的标准化，也是不可或缺的要素。标准物质作为核心 ，其可作为试剂方法和工作程序是否达到标准化的评价“金标准 ” 。

试剂生产厂家通过使用标准物质对于许多缺乏参考方法的核酸
、基因和蛋白等大分子的测定，使其定量具有溯源性
，从而在试剂层面上保证使用不同或相同试剂的临床实验室间结果具有可比性
。临床实验室使用标准物质，不但可以在试剂方法使用前 ，对其测定准确性进行有效的评价
，而且，可以充分评价实验室所制定的所有工作程序对保证检验结果准确的有效性。

图1. 临床实验室分子诊断技术标准化诸要素间的关系

综上所述 ，标准化是实现临床实验室分子诊断结果可比性的前提
，而标准化并非是单一因素，其由诸多关键性环节组成 ，核心是标准物质的研制及应用 。众所周知
，一个参考系统是由参考方法、标准物质和参考实验室等三个方面组成的，但临床实验室既不可能在其日常工作中普遍使用参考方法 ，也不可能都成为参考实验室。唯一可以普遍应用的就是标准物质
。标准物质的功能
，一是试剂生产厂家在制备试剂盒时，使用标准物质来保证其试剂检测结果的溯源性；二是临床实验室工作人员在实际工作中 ，使用标准物质来验证试剂方法 、工作程序的实际有效性。这些都是保证日常检验结果准确性的必由之路，也是不同实验室间结果走向有条件互认的前提 。

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